Након 25 дана статичке инкубације на 28°C, лаказа из *Pleurotus ostreatus* NRC620 показала је највећу активност у медијуму за гљивичну културу. Оптималне вредности pH и температуре за овај ензим биле су 3,0 и 70°C, респективно. Након 2 сата инкубације на 40°C и 50°C, активност ензима задржала је 68,33% и 59,61%, респективно. Након 2 сата инкубације у цитрат-фосфатном пуферу (pH 7,0), активност ензима је остала на 100%. Додавање 10 mM MgSO₄ и CuSO₄ повећало је активност ензима за приближно 21% и 35%, респективно, док су NaCl, MnCl₂, KCl и CaCl₂ инхибирали активност ензима. Коришћењем ABTS-а као супстрата, кинетички параметри (Km и Vmax) лаказе *Pleurotus ostreatus* NRC 620 били су 1,99 mM и 16.217 μmol min−1 L−1, респективно. Ензимски третман узорака сока од јабуке значајно је смањио и pH и вискозност, а ово смањење је било у корелацији са повећањем времена складиштења. Третман лаказом је резултирао благим смањењем укупног садржаја фенола у соку од јабуке, али није примећено смањење антиоксидативне активности.
Последњих година, истраживачи су се фокусирали на примену зелене биотехнологије у прехрамбеној индустрији. Лаказа је један од најкориснијих ензима у прехрамбеној индустрији, проналазећи примену у областима као што су прерада сокова, печење, стабилизација вина и побољшање органолептичких квалитета прехрамбених производа.1Многе више биљке и микроорганизми луче лаказу,2и гљивице као што су деутеромицете, аскомицете и базидиомицете такође могу да производе лаказу.3Лаказа (EC 1.10.3.2) је плава оксидаза која редукује молекуларни кисеоник до воде користећи систем који се састоји од три различита атома бакра, чиме оксидује различита фенолна једињења и ароматичне амине. Током производње воћних и поврћних сокова, ензимско и неензимско потамњивање су критична питања.4Пошто ове супстанце негативно утичу на боју, укус и арому сока, морају се уклонити.5
Од свег воћа, јабуке се највише конзумирају широм света и у Европској унији. У 2019. години, производња јабука је била трећа на свету, прелазећи 87 милиона тона.6Јабуке садрже бројна фенолна једињења, укључујући флавоноиде и фенолне киселине као што су кафеинска киселина и хлорогенска киселина.7Пошто се сок од јабуке обично конзумира у свом бистром облику, приближно 50% до 90% фенолних компоненти се губи током процеса филтрације.8Данас, потрошачи имају тенденцију да бирају минимално прерађене производе, као што је мутни сок од јабуке са високим садржајем полифенола. Међутим, због високог садржаја фенола, ова врста сока од јабуке је посебно подложна промени боје и потамњењу.9Различите технологије, укључујући методе термичке обраде као што је пастеризација на 60–90°C, користе се за смањење или спречавање потамњења сока од јабуке.10Међутим, према истраживању Сауцеда-Галвеза11, термичка обрада може уништити испарљиве хемикалије и утицати на органолептичке квалитете сока од јабуке. Алтернативе методама термичке обраде укључују суперкритични угљен-диоксид, ултраљубичасто зрачење, ултразвук, висок хидростатички притисак или хомогенизацију под високим притиском.12Ефикасност ових технологија и принос одговарајућих воћних сокова зависе од коришћених параметара и карактеристика производа. Њихова широка употреба је ограничена високим трошковима, неповољним ефектима на квалитет неких прехрамбених производа или неадекватном инактивацијом ензима.13,14
Лаказа се може користити за стабилизацију и бистрење воћног сока.15Гокмен и др.16Препоручују употребу лаказе за бистрење воћног сока јер ефикасно уклања фенолна једињења претварајући их у полимере или олигомере који се лако уклањају било којом ултрафилтрационом мембраном, омогућавајући соку од јабуке да одржи стабилну боју и бистрину до шест недеља на 50°C. Пречишћена лаказа *Trichoderma* је имобилизована на перлама алуминијумског оксида и коришћена за селективно уклањање једињења страног укуса изазваних микробном контаминацијом сока од јабуке.17
Приближно 80-90% испарљивих компоненти сока од јабуке су естри и алдехиди, који соку дају јединствену арому.18Лаказа из *Trametes versicolor* је имобилизована на јефтиној подлози направљеној од природних влакана младих љуски кокосових ораха за бистрење сока од јабуке.19Претходне студије су истраживале стабилизацију сока од јабуке (боја и замућеност) коришћењем метода без ензима или имобилизације, или у комбинацији са ултрафилтрацијом.5,19Међутим, утицај гљивичних лаказа на физичко-хемијска својства сока од јабуке током складиштења остаје нејасан. Стога је циљ ове студије био да се експериментално испитају промене у физичко-хемијским својствима, садржају фенолних једињења и антиоксидативној активности сока од јабуке након третмана гљивичним лаказама и двонедељног складиштења у фрижидеру. Лаказе имају способност да оксидују фенолна једињења, што их чини перспективним за употребу у различитим индустријским процесима, укључујући бистрење сока. Ова студија је испитала лаказе из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, фокусирајући се на идеалне услове за њихову активност и ефикасност у бистрењу сока. Иако су истраживања буковача (P. ostreatus NRC 620) још увек ограничена, претходне студије су испитивале ензиме из различитих гљивичних извора, као што су Trametes versicolor и Ganoderma lucidum. Циљ ове студије био је да се процени потенцијална примена овог ензима у прехрамбеној индустрији и истакну његова јединствена својства, посебно његов идеалан pH и температуру.
2,2′-Азооксибис(3-етилбензотиазолин-6-сулфонска киселина) (ABTS) је купљен од Sigma-Aldrich (Канада). Сви остали реагенси су били аналитичког квалитета.
Центар за сакупљање микробних култура Националног истраживачког центра добио је познати сој буковаче NRC620. Након субкултуре, овај сој је чуван на косим агаром од кромпирове декстрозе на 4°C. Метода припреме инокулума била је следећа: 10 дана стар, потпуно развијен мицелијум је инокулиран на плоче од кромпирове декстрозе агара и инкубиран на 28°C. Након 10 дана, три блока мицелија пречника 12 mm су уклоњена из агара помоћу стерилног металног бушача и стављена у Ерленмајерове боце од 250 mL са памучним чеповима који садрже 50 mL стерилисаног медијума за култивацију (pH 5,0, као што је претходно описано од стране Отмана и др.20). Културе су инкубиране на 28°C током 18 дана. Културе су затим филтриране кроз Whatman No. 1 филтер папир, а добијени супернатант је служио као извор ензима.
Лаказна активност је одређена коришћењем ABTS-а као супстрата. Реакциона смеша (2 mL) садржала је 500 μL 0,3 mM ABTS-а (раствореног у 0,1 M натријум цитратном пуферу, pH 4,5) и потребну количину узорка ензима разблаженог дестилованом водом.21,22С обзиром на то да лаказа може оксидовати ABTS на собној температури (28 °C ± 2), оксидација ABTS-а је одређена мерењем повећања апсорбанције на 420 nm (ε420= 36.000 цм-1 M -1) коришћењем Agilent Carry-100 UV спектрофотометра. Једна јединица лаказне активности била је потребна за оксидацију 1 μmol ABTS-а у минути. Концентрација протеина је одређена Бредфордовом методом користећи говеђи серумски албумин као интерну контролу.23,24
Након добијања ензима из соја буковаче NRC 620, његова активност је мерена у различитим интервалима култивације током 25 дана под статичким условима на 28 °C.
Да би се проучио утицај температуре на активност лаказе, експерименти су спроведени у температурном опсегу од 20 до 90 °C. Пре додавања ензима и започињања реакције, пуфер (0,1 М натријум цитрат, pH 4,5) и супстрат (ABTS) су помешани и инкубирани 5 минута на различитим температурама. Термичка стабилност ензима је процењена инкубацијом у 0,05 М натријум фосфатном пуферу (pH 7,0) на 40, 50, 60 и 70 °C током 2 сата, респективно. Резидуална активност је затим процењена коришћењем ABTS супстрата.
Утицај pH вредности на активност лаказе процењен је коришћењем ABTS-а као супстрата у 0,1 M цитрат-фосфатним пуферима са pH опсегом од 2,5 до 7,0. Раствор ензима је инкубиран на 40°C током два сата у 0,1 M цитратном и Tris пуферима (pH 3, 4, 6 и 7) да би се проценила стабилност pH вредности. Резидуална активност са ABTS-ом као супстратом израчуната је након инкубације.
Лаказа је инкубирана 10 минута у натријум-фосфатном пуферу (0,05 M, pH 7,0) који садржи различите металне јоне (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ и Mn2+) у концентрацијама од 2,5 mM и 10 mM, респективно. Затим је додат супстрат (ABTS) да би се започела реакција, а затим је процењена релативна активност.
Оксидација ABTS-а лаказом при различитим концентрацијама (0,025–3 mM) мерена је при pH 4,5 да би се одредили кинетички параметри (Vmax и Km). КинетикаконстантеМихаелис-Ментенове једначине израчунате су коришћењем Лајнвивер-Берковог графика, који приказује реципрочну вредност брзине реакције као функцију концентрације супстрата. Кинетичке константе су израчунате из Лајнвивер-Берковог графика коришћењем софтвера GraphPad Prism верзије 6.01.
Након темељног прања јабука водом из славине, пресечене су на пола и исцеђене помоћу потпуно аутоматског соковника за јабуке Braun MP80 (произведеног у Немачкој). Сок је филтриран кроз четири слоја газе. Контролној групи нису додати ензими, док је 2,0% лаказе (најефикаснија тестирана концентрација) додато свеже припремљеном соку од јабуке, који је затим чуван на 4°C две недеље.
Титрабилна киселост (TA) и pH су одређени према методи Боултона и др.ал.27pH вредност сваког узорка је мерена помоћу дигиталног pH метра (JENWAY 3510 pH метр). Титрабилна киселост (TA) је израчуната на основу јабучне киселине коришћењем следеће формуле.
Где су V и C запремина (mL) и концентрација (0,1 mol/L) раствора натријум хидроксида који се користи у титрацији, респективно. K је коефицијент конверзије јабучне киселине, једнак 0,067, а W је маса (g) сока од јабуке.
Укупне растворљиве чврсте материје (Порез на добит) садржај свих узорака сока одређен је помоћу џепног рефрактометра PAL-1 (ATAGO, Токио, Јапан). Након сваког мерења, оптичко сочиво је испрано дејонизованом водом, а сваки узорак сока од јабуке је тестиран три пута. Вредност за сваки узорак израчуната је усредњавањем три мерења. Средња вредност ± стандардна девијација за сваки узорак сока од јабуке такође је израчуната усредњавањем ових резултата.
Вискоеластичност узорака сока од јабуке процењена је помоћу ротационог вискозиметра (RV, Rheotest 2, Немачка). Узорак је смештен унутар цилиндра „S2“ вискозиметра. Привидна вискозност је представљена нагибом криве напона смицања у односу на брзину смицања, која је израчуната из напона смицања и одговарајућих кривих при различитим брзинама смицања (од 1,00 до 437,4 s⁻¹). Формула за израчунавање привидне вискозности је следећа:
Где је η привидна вискозност (cP), τ је смицајни напон (dyn/cm²), γ је брзина смицања (sec⁻¹), а (τ) се израчунава коришћењем вредности обртног момента (α) и цилиндра (Z) користећи следећу формулу: τ = Z . α.
Индекс потамњивања је одређен према методи Меидава и др.ал.29Узорак сока од 10 мл је центрифугиран на 2750 x g током 10 минута. 5 мл супернатанта сока је помешано са 5 мл 95% етанола. Апсорбанција смеше је мерена на 420 nm коришћењем Shimadzu UV спектрофотометра (UV-1601 PC).
Укупни садржај фенола (TPC) је одређен колориметријски коришћењем Фолин-Чокалтеу реагенса како је описано од стране Боултона и др.[27]]. Стандардна крива галне киселине је конструисана за концентрације од 0 до 500 мг/Л (r²= 0,997). Резултати су изражени као еквиваленти галне киселине (mg GAE/mL).
Додајте 125 μL дестиловане воде и 2850 μL FRAP раствора у 25 μL сока од јабуке и оставите смешу у мраку30мин. Затим измерити апсорбанцију на 593 nm користећи Shimadzu UV спектрофотометар (UV-1601 PC). FRAP реагенс је припремљен мешањем 300 mM ацетатног пуфера (pH 3,6), 20 mM гвожђе(III) хлорида и 10 mM 2,4,6-трис(2-пиридил)триазина (TPTZ) (раствореног у 40 mM HCl) у односу 10:1:1. Стандардна крива је генерисана коришћењем Trolox-а као стандарда (Р²= 0,999), а резултати су изражени као μM тролокса/mL.
Антиоксидативна активност третираних и нетретираних сокова одређена је коришћењем DPPH методе како би се проценила њихова способност уклањања DPPH слободних радикала.31Десет микролитара сока је помешано са 1 мл раствора ДППХ (100 μМ) у метанолу. Након реакције у мраку током 30 минута, апсорбанција смеше је мерена на 517 nm коришћењем Шимадзу УВ спектрофотометра (УВ-1601 ПЦ). Резултати су изражени као еквиваленти тролокса (μМ тролокса/мл) на основу калибрационе криве (R2= 0,990).
Добијени подаци су показали да је максимална производња лаказе примећена код буковача NRC 620 до краја 18. дана ферментације, достижући активност од 1302 U/L. Ово је послужило као основа за одређивање оптималног времена култивације за производњу лаказе (Слика 1). Иако се производња ензима повећавала са повећањем времена култивације, стопа повећања није била директно пропорционална времену култивације; након 21 дан, активност ензима се повећала за само 90 U/L (на 1390 U/L). Стога је 18 дана на крају изабрано као оптимално време култивације како би се уравнотежио принос производа са економским користима повећаног времена култивације.
Утицај времена култивације на принос лаказе код Pleurotus ostreatus NRC 620. Три (12 mm) блока гљивичног мицелија инокулирана су у 50 ml стерилне подлоге, а затим култивисана на 28 °C током различитог времена.
У складу са другим студијама, наши резултати указују да је идеалан период културе за постизање вршне секреције лаказе од стране гљивица вероватно између 7 и 36 дана.32Према Езикеу и др.33, *Trametes polyzona* WRF03 је произвео највећу количину лаказе до краја деветог дана ферментације, са специфичном активношћу од 1637 U/mg протеина. Штавише, Отман и др.34утврђено је да *Trichoderma harzianum* S7113 излучује велику количину лаказе петог дана културе. Брзина производње лаказе достигла је врхунац активности четрнаестог дана, а затим је постепено опадала.34Иако се секреција ензима може јавити и током главне фазе раста, она обично достиже врхунац током средње фазе и покреће се потрошњом извора угљеника или азота.34,35
Иако је лаказа из Pleurotus ostreatus NRC 620 показала високу активност у широком температурном опсегу од 50°C до 80°C, приближавајући се врхунцу активности (69–98%), њена максимална активност је примећена на 70°C (Сл. 2а). Ван овог температурног опсега, активност ензима се смањила на приближно 70°C. Ови резултати указују на то да је ензим активан на високим температурама, вероватно зато што висока температура повећава кинетичку енергију реакције.
Утицај температуре реакције (а) и pH вредности (б) на активност лаказе код *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Температуре у распону од 20 до 90 °C постигнуте су претходном инкубацијом смеше на различитим температурама током 5 минута пре додавања ензима и започињања реакције. Утицај pH вредности на активност лаказе процењен је коришћењем ABTS-а као супстрата у растворима који садрже 0,1 M цитрат-фосфатни пуфер у опсегу pH вредности од 2,5 до 7,0.
Према Езикеу и др.ал.33Оптимална температура за *Trametes polyzona* WRF03 лаказу је 55 °C, што је исто као и за *Ganoderma lucidum*.лаказе36и слично оптималној температури (50 °C) за *Trametes polyzona* KU-RNW02737лаказа . Балдријан38напомиње да је, као и за друге ензимске системе који разграђују лигнин, идеалан температурни опсег за лаказу између 50 и 70 °C.
Резултати су показали да је ензим показао највећу активност при pH 3,0, достижући 94% активности при pH 3,5. Међутим, остао је активан у широком pH опсегу од 2,5 до 7,0 (Слика 2б). Штавише, показао је већу активност у киселим условима у поређењу са неутралним или алкалним условима. Његова активност је остала најмање 77% у pH опсегу од 2,5 до 4,5, али је достигла само приближно 38% при pH 7,0. Оптимална pH вредност за лаказу из *Trametes polyzona* WRF03 била је 4,533, што је исто као pH вредност за лаказе из *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 и *Trametes hirsuta* 41. Међутим, према студији Чаирина и др.42, оптимална pH вредност за лаказу из *Polymorpha f. sp.* WR710-1 је 2,2, док је оптимална pH вредност за лаказу из *Polymorpha f. sp.* IBL-04 5,043. Везивање хидроксидних ањона (инхибитора лаказе) за атоме бакра Т2/Т3 лаказе може бити разлог смањене активности лаказе у неутралним или алкалним pH условима. Ово може пореметити унутрашњи пренос електрона из Т1 центра у Т2/Т3 центар, чимеограничавајућиензимска активност23,44
Инкубацијом ензима на различитим температурама, утврђено је да и време инкубације и температура утичу на стабилност ензима. Приметно је да је лаказа из *Trametes polyzona* NRC 620 показала већу стабилност на 40℃ и 50℃, задржавајући 68,33% и 59,61% своје почетне активности, респективно, након 120 минута (Слика 3а). Насупрот томе, под истим условима (40℃ и 50℃, 120 минута), лаказа из *Trametes polyzona* WRF03 задржала је 64,38% и 42,92% своје активности, респективно.33Напротив, повећање времена инкубације и температуре смањило је стабилност лаказе *Trametes polyzona* NRC 620; Након инкубације на 60℃ и 70℃ током 60 минута, њена активност се смањила на 39,24% и 1,72%, респективно (слика 3а). У складу са експерименталним резултатима, лаказа из *Trametes polyzona* WRF03 показала је већу стабилност на 40 и 50℃ током процеса термичке обраде.33Слично томе, Луангџаронкит и др.ал.37и председник и др.ал.42пријавили су стабилност лаказа из Trametes polyzona KURNW027 и Trametes polyzona WR710-1 на 50 °C током 1 сата, респективно. Као користан биокатализатор применљив у различитим биотехнолошким областима, лаказа би требало да има добру стабилност и перформансе у широком температурном опсегу.
Термостатска стабилност (а) и pH стабилност (б) лаказе из *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Термостатска стабилност је процењена инкубацијом раствора ензима у 0,05 M натријум фосфатном пуферу (pH 7,0) на 40, 50, 60 и 70 °C током 2 сата, респективно. pH стабилност је процењена инкубацијом раствора ензима у 0,1 M цитратном пуферу и Tris пуферу (pH 3, 4, 6 и 7) на 40 °C током 2 сата. Резидуална активност је израчуната коришћењем ABTS као супстрата након инкубације.
Да бисмо одредили оптималне услове за употребу и складиштење ензима, истражили смо утицај pH вредности на стабилност лаказе. Излагање различитим pH вредностима значајно је утицало на стабилност протеинске структуре, чиме је утицало на стабилност и активност молекула ензима. Резултати су показали да је ензим био мање стабилан у киселим условима, док је показао бољу стабилност на вишим pH вредностима (неутралне и алкалне области). При pH вредностима од 7,0, 6,0, 4,0 и 3,0, стопе задржавања ензима након 120 минута биле су приближно 100%, 62,54%, 52,39% и 11,14%, респективно (Слика 3б). Лаказа *Strombus multisus* WRF03 показала је већу стабилност на неутралним pH вредностима (5,5–6,5) и нижу стабилност на киселим pH вредностима (испод 4,0). Након 120 минута на pH вредностима од 5,5, 6,0 и 6,5, стопе задржавања ензима биле су приближно 82%, 100% и 93%, респективно.33Хаирин и др.42приметили су да је лаказа из Trametes polyzona WR710-1 била стабилна у pH опсегу од 6,0 до 7,0, док су Сајед и др.45показало је да је лаказа стабилнија у неутралним pH условима. Међутим, лаказа из Cerrena unicolor је такође показала стабилност у алкалним условима (pH 9,0).46Проучаване лаказе су показале високу стабилност у широком опсегу pH вредности. Ово може бити важна карактеристика за индустријске примене.
Пошто неки метални јони имају и стимулативне и инхибиторне ефекте на ензимску активност, њихови ефекти на ензимску активност морају се узети у обзир у индустријским применама. Ово је кључно јер су метални јони уобичајени загађивачи животне средине који могу утицати на стабилност и синтезу екстрацелуларних ензима.47Да бисмо истражили ефекте вишеструких металних јона на лаказу из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, спровели смо одговарајуће експерименте. Као што је приказано на слици 4, у зависности од врсте коришћеног метала, повећање концентрације металних јона од 2,5 mM до 10 mM негативно је утицало на функцију ензима. На пример,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺иCu²⁺може стимулисати и активирати ензимску активност, докНа⁺ , Мн²⁺ , Ca²⁺иК⁺могла је инхибирати активност ензима. При концентрацији од 10 mM, јони Cu²⁺ и Mg²⁺ били су најснажнији активатори активности лаказе из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, обезбеђујући степен активације од приближно 34% и 20%, респективно. Међутим, при концентрацији од 10 mM, јони Ca²⁺ били су најснажнији инхибитор лаказе, смањујући активност ензима за приближно 60%.
Утицај металних јона на активност лаказе Pleurotus ostreatus NRC 620. Лаказа је инкубирана 10 минута у натријум-фосфатном пуферу (0,05 M, pH 7,0) који садржи различите металне јоне у концентрацијама од 2,5 mM и 10 mM. Реакција је затим започета додатком супстрата (ABTS), након чега је мерена релативна активност.
Наши резултати су у складу са резултатима других аутора који су открили да Mg²⁺ и Cu²⁺ појачавају активност *Trametes polyzona* WRF03³. Кастањо и др.⁴⁸ су открили да је лаказа из *Xylaria* sp. донекле стимулисана јонима бакра (Cu²⁺). Штавише, Форутанфар и др.⁴⁹ и Си и др.⁵⁰ су спровели сличне студије на лаказама из *Paraconiothyrium variabile* и *Trametes pubescens*, респективно. Место везивања бакра типа II (T2) овог ензима може бити засићено са Cu²⁺ при датој концентрацији, што може објаснити стимулацију активности лаказе при вишим концентрацијама Cu²⁺³⁹. Пошто су лаказе гљивица беле трулежи оксидазе које садрже више атома бакра, ефекти јона бакра на активност лаказе су разноврсни и крећу се од стимулативних и инхибиторних до неутралних.⁵¹ Насупрот томе, Zhou et al[52]известио даCu²⁺инхибирао је лаказну активност тајванског подземног термита (Odontotermes formosanus). Међутим, лаказе Cerena sp. HYB07[53]и Clitocybe maxima[54]нису били погођени јонима бакра.
Специфичност супстрата је представљена његовим кинетичким параметрима (Km и Vmax); што је јачи афинитет везивања супстрата за ензим, то је нижа вредност Km и већа специфичност супстрата.3,21,55Кинетички параметри (Km и Vmax) лаказе из *Pleurotus ostreatus* NRC 620 одређени су коришћењем софтвера GraphPad Prism 6.0 цртањем Lineweaver-Burk графикона (слика 5). Када се користи ABTS као супстрат, резултати су били 1,99 mM и 16217 μmol.мин⁻¹ Л⁻¹,респективно. Елсајед и др.21известили су да су вредности Km за оксидацију ABTS биле 0,1 mM и 0,064 mM, респективно, што указује на висок афинитет изоензима Lac A и Lac B за ABTS. Штавише, вредности Vmax биле су 0,182 μmolмин⁻¹и 0,603 μmolмин⁻¹, респективно. Добијена вредност Km била је нижа од оне код Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); штавише, њихова вредност Vmax (1429 mmol min⁻¹) такође је биланижикада се користи ABTS као супстрат.33 Слично томе, вредности Km концентрација лаказе код Lentinus squarrosulus MR13 и Trametes sp. AH28-2 биле су 0,0714 mM и 0,025 mM, респективно, а вредности Vmax биле су 0,0091 mM min−1 и 0,67 mM min−1 mg−1 (у односу на ABTS), респективно.56,57
Испитан је ефекат концентрације ABTS-а на активност лаказе из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, и направљен је Лајнвивер-Берков график реципрочне вредности почетне брзине реакције у односу на концентрацију ABTS-а. Реакција оксидације ABTS-а са различитим концентрацијама (0,025–3,0 mM) лаказе мерена је при pH 4,5 да би се одредили кинетички параметри (Vmax и Km). Михаелис-Ментенове кинетичке константе израчунате су коришћењем Лајнвивер-Берковог графика реципрочне вредности брзине реакције у односу на концентрацију супстрата. Кинетичке константе су израчунате из Лајнвивер-Берковог графика коришћењем софтвера GraphPad Prism 6.01.
Традиционални ензими за бистрење, као што су пектиназе, хидролизују пектинске супстанце, смањујући вискозност и замућеност. Они ефикасно разграђују структурне полисахариде и често се користе у комбинацији са другим ензимима, као што су целулазе и хемицелулазе, ради побољшања приноса и бистрине. Међутим, пектиназе не циљају посебно фенолна једињења, која су главни доприносиоци замућењу и оксидативном потамњивању, посебно у соковима као што су сок од јабуке и грожђа.58Насупрот томе, лаказе катализују оксидацију фенолних једињења, полимеризујући их у веће, нерастворљиве молекуле који се могу уклонити седиментацијом или филтрацијом. Овај механизам не само да побољшава бистрину, већ и продужава рок трајања сока смањујући вероватноћу оксидативног потамњивања изазваног фенолним једињењима. Штавише, процеси бистрења на бази лаказа могу се спроводити под благим условима обраде (pH 3,5–5,5, температура 25–40 °C), што их чини погодним за деликатне сокове без угрожавања њихових нутритивних или органолептичких својстава.59Студије су показале да третман пектиназом може да избистри сок за 1-2 сата, док третман лаказом обично захтева дуже време реакције (3-6 сати) да би се потпуно редуковала фенолна једињења. Међутим, овај процес се може оптимизовати имобилизацијом ензима или комбиновањем лаказе са механичким методама бистрења.60У овој студији, ензимско профилисање сировог екстракта открило је значајне активности лаказе и α-амилазе, док су активности пектиназе и ксиланазе биле изузетно ниске, а активност целулазе није детектована. Стога је смањење замућености и садржаја фенола углавном последица дејства лаказе, док би промена вискозности могла бити делимично последица дејства амилазе.
Табела 1 приказује физичко-хемијске параметре свеже цеђеног сока од јабуке и узорака третираних лаказом. Резултати су показали да је принос свеже цеђеног сока од јабуке (71,59%) био нижи него код узорака третираних лаказом (87,34%). Ови резултати су у складу са налазима Пилника и Оранџа.61, који је навео да употреба ензима у преради воћа може повећати принос сока, побољшати филтрацију и добити висококвалитетни, бистри сок за концентрацију. Повећање приноса сока је углавном последица повећања садржаја растворљивих шећера у соку. Током ензимске хидролизе воћа, мезоглеја и пектин у ћелијским зидовима производа се уништавају и претварају у растворљиве супстанце као што су неутрални шећери и киселине.62.pH вредност сока од јабуке третираног ензимима била је значајно нижа него код контролне групе (P < 0,05), а pH вредност обе групе се значајно повећала током складиштења (Табела 1). Ови резултати су у складу са резултатима Марка и др.63, који је приметио да се pH вредност сока од индијског ораха смањила након складиштења након термичке обраде. Разградња пектина и стварање галактуронске киселине након третмана ензимима могу бити одговорни за повећање pH вредности током складиштења. pH вредност узорака третираних ензимима остала је између 4,05 и 4,31 током складиштења, док се pH вредност нетретираног сока од јабуке кретала између 4,12 и 4,33.
Укупна киселост (TA) и нетретираних и узорака третираних лаказом показала је опадајући тренд са повећањем времена складиштења (Табела 1). Смањење киселости приписано је конверзији органских киселина у угљене хидрате или ензимским реакцијама, као и оксидацији током складиштења сока.64Укупна киселост контролног сока од јабуке и узорака третираних ензимима била је нижа него код других сокова (сок од јагоде 0,9%, сок од шљиве 2,2%, сок од кумквата 1,0%, сок од кајсије 2,4%, сок од поморанџе 0,8%), али слична киселости код других сокова (нпр. сок од крушке 0,3%).62Ове разлике у необрађеном свеже цеђеном соку од јабуке могу бити последица различитих фактора као што су услови узгоја, генетски фактори, ниво зрелости и методе обраде.65Смањење укупне киселости контролног и сока од јабука третираног лаказом је у складу са резултатима које су представили Синг и др.66у вези са смањењем укупне киселости сока од јабуке Ђин Нуо након 74 дана складиштења. С друге стране, Ошмјански и Војдило67нису пронашли никакве значајне промене у киселости сока од јабуке приликом проучавања ефекта традиционалних метода бистрења.
Резултати представљени у Табели 1 показују да је вредност укупних растворљивих чврстих материја (TSS) у соку од јабуке третираном лаказом била већа него у нетретираном узорку. Ови резултати су у складу са објављеним студијама.68Штавише, Табела 1 показује да је вредност обичне густине сока (TSS) контролне групе са јабуковим соком била 9,58 у почетном тренутку и достигла је 11,05 до краја периода складиштења. Ове вредности су ниже од вредности обичне густине сока свежег јабуковог сока које су известили Хамид и др.69(11,2 и 11,80, респективно). Вредност укупних растворљивих материја (УРМ) узорака сока од јабуке третираних лаказом значајно се повећала, почевши од 11,23 и достижући 12,93 након две недеље складиштења на 4°C (Табела 1). Слично повећање УРМ током складиштења примећено је и код агрума, лимуна и слатких поморанџи. Повећање укупних растворљивих материја (УРМ) током складиштења може бити последица хидролизе полисахарида (скроб) у моносахариде (шећере), повећања концентрације услед дехидрације сока и разградње пектина у соку у растворљиве материје. Повећање укупних растворљивих материја (УРМ) вероватно је последица повећања растворљивих шећера, који могу настати конверзијом пектина или целулозе у растворљиве шећере помоћу пектина или целулазе, респективно, или хидролизом скроба у шећере, како су известили Хамед и др.69.Утицај лаказе на својства сока од јабуке може се визуелно посматрати, јер сок од јабуке третиран лаказом показује бољу течност и нижи вискозитет од нетретираног сока. Ово запажање је забележено у Табели 1; Вискозитет узорка третираног ензимом био је 1,87 cP, док је вискозитет контролног узорка био 2,95 cP. Ово значајно смањење вискозности је вероватно последица већег капацитета задржавања воде супстанци сличних пектину и формирања кохезивне мрежне структуре.
У овој студији, испитан је ефекат лаказе на индекс потамњивања (ИП) сока од јабуке мерењем апсорбанције на 420 nm помоћу спектрофотометра. Резултати су приказани у Табели 1. Током складиштења, ИП узорака сока од јабуке, како у третираној тако и у нетретираној групи, показао је постепени тренд раста. ИП одражава степен потамњивања и може послужити каоважаниндикатор ензимских и неензимских реакција потамњивања. Апсорбанција се значајно повећала током складиштења (P < 0,05). На крају складиштења,А420Вредност узорака сока од јабуке у контролној и групи третираној ензимима повећала се за око 217% и 121%, респективно (Табела 1). Резултати показују да третман ензимима може ефикасно смањити степен потамњења за око 56%. Резултати Безере и др.[19]] су у складу са нашим резултатима; Користили су влакна лаказе-глутаралдехида-кокоса за бистрење сока од јабуке, смањујући његову оригиналну боју за 61%.
Иако полифеноли у воћним соковима имају позитивне нутритивне и терапеутске ефекте на људски организам, они такође могу реаговати са протеинима, узрокујући замућење сока, седиментацију или замућење, чиме се мења укус и арома производа и смањује његов рок трајања.71Циљ ове студије био је безбедно смањење садржаја фенолних једињења у соку од јабуке коришћењем лаказе из Pleurotus ostreatus NRC 620. Резултати представљени у Табели 1 показују да је укупни садржај фенолних једињења у соку од јабуке третираном лаказом значајно смањен пре складиштења на 4 °C. Штавише, укупни садржај фенолних једињења се такође смањио током складиштења у оба проучавана узорка (Табела 1). Истраживање Сандри и др.72показало је да сок од јабуке третиран ензимима може задржати своју антиоксидативну активност и садржај фенолних једињења. Међутим, резултати студије коју су спровели Летера и др.73показују да третман сока од поморанџе гљивичном лаказом може смањити садржај фенолних једињења у њему и до 45%.
Показано је да фенолна једињења имају својства као што су уклањање слободних радикала, редукција и гашење синглетног кисеоника, пренос атома водоника и донација електрона слободним радикалима, што их чини снажним антиоксидансима.74Стога су у овој студији коришћене методе засноване на DPPH и FRAP за процену утицаја лаказе на антиоксидативну активност сока од јабуке складиштеног у фрижидеру током 14 дана (Табела 2). Обе методе су показале повећање антиоксидативне активности током складиштења, што може бити последица повећања слободних фенолних једињења или формирања производа Мајларове реакције (MRP), при чему су производи Мајларове реакције вероватно узрок повећања антиоксидативне активности.75Неензимске реакције потамњивања (укључујући разградњу аскорбинске киселине, Мајларове реакције и киселином катализовану разградњу шећера) производе смеђе пигменте (меланоидине). Интермедијарни производи разградње аскорбинске киселине и производи разградње шећера (као што су карбонилна једињења) могу реаговати са аминокиселинама путем Мајларових реакција.76Иако је потамњивање воћа и поврћа током складиштења опширно проучавано, наше разумевање ових реакција остаје ограничено.77У поређењу са FRAP методом, сок од јабуке третиран лаказом показао је значајно нижу антиоксидативну активност DPPH методом (Табела 2), а антиоксидативна активност свих узорака се значајно повећавала са повећањем времена складиштења. У овој студији коришћене су две различите методе за одређивање антиоксидативне активности јер се њихови принципи разликују. DPPH метода мери способност неутрализације слободних радикала, док FRAP метода мери способност редукције јона гвожђа. Стога се препоручује коришћење више метода за одређивање антиоксидативне активности како би се боље разумела антиоксидативна активност проучаваних узорака.78
Један од кључних налаза ове студије је да лаказа *Pleurotus ostreatus* NRC 620 показује оптималну активност на 70°C и pH 3,0. У поређењу са другим гљивичним лаказама које се обично користе за бистрење сока, као што су лаказе *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 показује већу термичку стабилност и киселији pH. Лаказе из *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum* типично показују оптималну активност у опсегу од 50-60°C и при pH вредностима између 3,5 и 5,0. Ова разлика може допринети побољшаној ефикасности бистрења сока, посебно код киселих сокова где је стабилност при нижим pH вредностима критична. Јединствена карактеристика *P. У поређењу са другим проучаваним гљивичним лаказама, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 показује способност да ефикасно функционише у захтевнијим условима. Његова виша оптимална температура активности указује на потенцијалне предности у индустријским применама, као што су брже реакције и смањена микробна контаминација. Његов низак pH, који је погодан за киселу природу многих сокова, може бити користан у процесима бистрења сокова. Ови резултати оправдавају даља истраживања за примену у великим размерама, чинећи *Pleurotus ostreatus* NRC 620 одрживом алтернативом традиционалним изворима гљивичне лаказе. У поређењу са претходним студијама, открили смо да је оптимална температура 60°C, а оптимални pH 3,0. Након реакције на 60°C током 80 минута, лаказа *Ganoderma lucidum* је задржала...46% своје активности.79 Према Курниавати и Нисел80Ензими *Ganoderma lucidum* показују одличну до умерену стабилност на 25°C и pH вредностима у распону од 5,0 до 8,0, и стабилност на pH 6,0 и температурама у распону од 10 до 30°C. У овој студији, открили смо да су оптималне pH вредности и температуре за ензимску активност за *Pleurotus ostreatus* биле 3,0 и 70°C, респективно. Након инкубације на 40°C и 50°C током два сата, ензим је задржао 68,33% и 59,61% своје активности, респективно. Штавише, лаказа Pleurotus ostreatus NRC 620 показала је високу активност у широком температурном опсегу од 50°C до 80°C, скоро достижући максималну активност (69%–98%), са максималном активношћу примећеном на 70°C.
Закључно, лаказа буковаче NRC620, добијена под статичким условима, показала је оптималну активност и стабилност у различитим pH и температурним условима, демонстрирајући супериорну стабилност у поређењу са другим изворима ензима. Додавање 10 mM MgSO₄ и CuSO₄ повећало је активност ензима за приближно 21% и 35%, респективно. Када се преради у сок од јабуке, ензим је смањио pH и вискозност, док се садржај фенола само незнатно смањио током складиштења.
Резултати потврђују потенцијал лаказе у прехрамбеној индустрији, посебно у бистрењу пића. Специфичним разлагањем фенолних једињења, лаказа не само да смањује замућеност и побољшава бистрину, већ и одржава квалитет воћних сокова под благим условима рада. За разлику од традиционалних средстава за бистрење као што су желатин, бентонит и силика гел, лаказа не ствара отпад нити уклања пријатне ароме из пића, што је чини еколошки прихватљивијом и одрживијом опцијом. Штавише, у поређењу са другим ензимима и методама филтрације, лаказа нуди циљано и исплативо решење без угрожавања квалитета производа.
Кјомухимбо, Х.Д. и Бринк, Х.Г. Примене и стратегије имобилизације лаказа које садрже бакар; преглед. Хелион 9, е13156 (2023).
Време објаве: 15. децембар 2025.